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微生物培养基配制与灭菌方法及步骤

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微生物培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型,对营养物质的要求也各不相同,加之研究的目的不同,所以培养基的种类很多,使用的原料也各有差异,但从营养角度分析,微生物培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外,培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。为了达到特定要求的研究,需要进行培养基配制和灭菌,那么微生物培养基该如何配制与灭菌呢?

培养基制备

1.配制溶液

向容器内加入所需水量的一部分,按照培养基的配方,称取各种原料,依次加入使其溶解,最后补足所需水分,对蛋白胨、肉膏等物质,需加热溶解,加热过程所蒸发的水分,应在全部原料溶解后加水补足。

配制固体培养基时,先将上述已配好的液体培养基煮沸,再将称好的琼脂加入,继续加热至完全融化.并不断搅拌,以免琼脂糊底烧焦。

2.调节pH

pH试纸(pH电位计、氢离子浓度比色计)测试培养基的pH,如不符合需要,可用10%HCl10%NaOH进行调节,直到调节到配方要求的pH值为止。

3.过滤

用滤纸、纱布或棉花趁热将已配好的培养基过滤.用纱布过滤时,最好折叠成六层,用滤纸过滤时,可将滤纸折叠成瓦棱形,铺在漏斗上过滤。

4.分装

已过滤的培养基应进行分装.如果要制作斜面培养基,须将培养基分装于试管中.如果要制作平板培养基或液体、半固体培养基,则须将培养基分装于锥形瓶内。分装时,一手捏松弹簧夹,使培养基流出,另一只手握住几支试管或锥形瓶,依次接取培养基。分装时,注意不要使培养基粘附管口或瓶口,以免浸湿棉塞引起杂菌污染。装入试管的培养基量,视试管和锥形瓶的大小及需要而定.一般制作斜面培养基时,每只15×150毫米的试管,约装34毫升(1/41/3试管高度),如制作深层培养基,每只20×220毫米的试管约装1215毫升。每只锥形瓶装入的培养基,一般以其容积的一半为宜。

5.加棉塞

分装完毕后,需要用棉塞堵住管口或瓶口。堵棉塞的主要目的是过滤空气,避免污染.棉塞应采用普通新鲜、干燥的棉花制作,不要用脱脂棉,以免因脱脂棉吸水使棉塞无法使用。制作棉塞时,要根据棉塞大小将棉花铺展成适当厚度,揪取手掌心大小一块,铺在左手拇指与食指圈成的圆孔中,用右手食指插入棉花中部,同时左手食指与姆指稍稍紧握,就会形成1个长棒形的棉塞.棉塞作成后,应迅速塞入管口或瓶口中,棉塞应紧贴内壁不留缝隙,以防空气中微生物沿皱折侵入。棉塞不要过紧过松,塞好后,以手提棉塞、管、瓶不下落为合适。棉塞的2/3应在管内或瓶内,上端露出少许棉花便于拔取。塞好棉塞的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆札,准备灭菌。

6.制作斜面培养基和平板培养基

培养基灭菌后,如制作斜面培养基和平板培养基,须趁培养基未凝固时进行。

(1)制作斜面培养基。在实验台上放1支长0.51米左右的木条,厚度为1厘米左右,将试管头部枕在木条上,使管内培养基自然倾斜,凝固后即成斜面培养基。

(2)制作平板培养基。将刚刚灭过菌的盛有培养基的锥形瓶和培养皿放在实验台上,点燃酒精灯,右手托起锥形瓶瓶底,左手拔下棉塞,将瓶口在酒精灯上稍加灼烧,左手打开培养皿盖,右手迅速将培养基倒入培养皿中,每皿约倒入10毫升,以铺满皿底为度.铺放培养基后放置15分钟左右,待培养基凝固后,5个培养皿一叠,倒置过来,平放在恒温箱里,24小时后检查,如培养基末长杂菌,即可用来培养微生物。

 

微生物检查培养基常用的灭菌方法

 

1、湿热灭菌:

蒸汽在冷凝时释放出大量潜能,并且蒸汽具有强大穿透力,蒸汽的湿热破坏菌体蛋白质和核酸的化学键,使酶失活,微生物因代谢障碍而死亡。湿热灭菌的效果,取决于致死温度和致死时间。致死温度是杀灭微生物的极限温度。致死时间是在致死温度下杀灭全部微生物所需时间。

 

高压蒸汽灭菌适合于耐高温培养基、接种器械和蒸馏水的灭菌。培养基分装后应立即灭菌,应在当天内完成灭菌工作,不可过夜。消毒时间不宜过长,也不能超过规定的压力范围,否则有机物质就会在高温下分解,失去营养作用,也会使培养基变质、变色,甚至难以凝固。

 

培养基配制后,应按验证过的高压灭菌程序灭菌。2015版《中国药典》第三次公示稿,1106 非无菌产品微生物限度检查:控制菌检查法中,列出部分培养基的灭菌条件,如下表所示:

培养基名称

灭菌条件

肠道菌增菌液体培养基

加热至100 30分钟,立即冷却

紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基

加热煮沸(不能在高压灭菌器中加热)

RV 沙门菌增菌液体培养基

灭菌温度不能超过115

木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基

加热至沸腾(不能在高压灭菌器中加热)

其他未明确标示灭菌方法的培养基,按供应商标签所示灭菌方法灭菌或按验证过的高压灭菌程序灭菌。

 

2、过滤除菌:

一些抗生素及有机物等,遇热容易分解,不能与培养基一起进行高温灭菌,而要使用细菌过滤器滤去其中的杂菌,例如含抗生素的沙氏葡萄糖琼脂培养基。过滤后的溶液要立即加入培养基中,若为液体培养基,可在培养基冷却至30℃时加入;若为固体培养基,必须在培养基凝固之前(50-60℃)加入,振荡使溶液与其他成分混合均匀。

 信息来源:食品微生物检测 公众号

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